ICH Q5B r-DNA由来のタンパク質製剤製造のための発現コンストラクトの解析

ICH Q5Bはr-DNA由来のタンパク質製剤製造のための発現コンストラクトの解析についてのガイドラインです。発現コンストラクトは生物学の用語で、プロモーター(発現開始を促す配列)、遺伝子、複製オリジン(DNA複製の開始点になる配列)などを含むDNAのことを指します。

コンストラクトについては生物学の基礎が無いとパッと理解しにくい部分ですが、基本的にはセントラルドグマ(DNAがRNAに転写される→RNAがタンパク質に翻訳される)の過程をたどって組み換え生物学的製剤が作られていると考えて良いかと思います。DNAがRNAに転写される際にはRNAポリメラーゼという酵素がやって来て、DNAをRNAに転写(コピー)します。このコピーのコピー機RNAポリメラーゼです。コピー機はそれだけではどこからコピーしたらよいのかわからないため、プロモーターという、転写を開始する印がDNA上にあります。このプロモーターを識別してRNAポリメラーゼはRNAを合成します。このRNAに転写される部分が(正確にはそうでない場合もありますが)遺伝子配列です。RNAに転写された遺伝子配列はそのままでは機能できないため、RNAからアミノ酸鎖であるタンパク質に翻訳されます。生物学的製剤で薬効を示すのはこのタンパク質で、薬効の効きを変えたり、ターゲットを指定したりするために遺伝子配列を少しいじります。プロモーターと遺伝子配列は共にDNAで、それだけではただの物質です。これを大腸菌などに増やしてもらうのですが、増やしてもらうためにはDNAの複製(これは丸々コピーすること)が必要です。DNAの複製をするためにはOrigin(複製オリジン)が必要で、大腸菌はこのOriginと呼ばれるDNA配列を見つけて、そこからDNAの複製を行います。この3つ(プロモーター、遺伝子配列、オリジン)などを1つの環状のDNAにまとめます(プラスミドと呼ぶ)。プラスミドを特定の方法でヒト細胞などに入れると、組み換え(Recombinant)という現象が起きることがあります。組み換えでは、プロモーターと遺伝子配列のセットのDNAが細胞の染色体に挿し込まれます。挿し込まれたプロモーターと遺伝子配列はその細胞でセントラルドグマにしたがいタンパク質生成に用いられます。このとき、プロモーターとDNAのセットを持ち運ぶプラスミドのことをベクターと呼びます。ICH Q5Bは、このr-DNA(recombinant DNA、組み換えDNA)の評価法について記載されたものです。

ICH Q5Bの対象は原核・真核生物での組み換えDNAから生成するタンパク質製剤です。組み換えDNAの評価は核酸分析の方法を用いて行い、生成するタンパク質の評価では配列・立体構造・修飾などを調べます。

組み換えDNAの評価はその配列(Sequence、シークエンス)が正確に保存されていることを確認することで行います。一般的にDNAの複製時にはDNAの変異が低確率で起こります。変異が入ったタンパク質は正常な機能を果たさないため、DNA配列の維持は製品の効能・副作用に影響を及ぼします。タンパク質に翻訳された後、多くのタンパク質は糖鎖などによる修飾を受けます。修飾もタンパク質の機能に重要な働きを持つため、治験時と同等の修飾が起こっているのか確認することも重要となります。

DNA配列の確認はシークエンサという機器を用いて行います。組み換えDNAは染色体DNAよりはるかに小さく、検出が困難なので、組み換えDNA部分だけ増幅する必要があります。増幅にはクローンDNAやPCRなどを用います。解析では染色体上の組み換えDNAだけではなく、mRNAやmRNAを逆転写したcDNAなどの配列確認も行います。核酸の解析法は日進月歩(とは言ってもそれほど進まない)ですので、その時々に最適な手法を選びます。

コンストラクトに関してはDNA配列の起源や生成法(どの生物のどのプロモーターと遺伝子を用い、改変したならどこを改変したのか)の記載が承認申請に必要となります。ベクターにはコンストラクト以外の遺伝子が乗っているときもあるため、発現の可能性があるなら記載が必要です。ベクターを細胞に取り込ませる(導入)方法についても説明します。

タンパク質製剤の製造時にはMCB/WCBを作成します。MCB/WCBについては十分に検証の上、製造に利用します。MCB/WCBの維持管理の履歴は保存します。MCB/WCBの検証では、制限酵素(制限断片)マッピング、コピー数の確認、変異や組み換え箇所、発現タンパク質のアミノ酸配列などを確認します。実際に製造に利用する細胞では使用期限を設定し、製造中のDNA配列の維持について検証しておきます。